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Cytostar-T プレート

目次

実験概要
重要なポイント
細胞培養プロトコル
アプリケーション
装置と計測

実験概要

Cytostar-Tプレートは、SPA（Scintillation proximity assay）に利用され、通常の生理学的条件下で、細胞内の幅広い生物学的反応をリアルタイムかつ非侵襲的に定量することができます。

このプレートは、滅菌された組織培養用のマイクロプレートであり、付着細胞培養だけでなく浮遊細胞培養にも利用可能です。各ウェルの平面状の透明な底面は、シンチレータとポリスチレンの均質な混合物で構成されています。底面が透明なので、ウェルに播種された細胞の増殖を観察できます。放射性同位元素（3H、14C、35S、33P、45Ca、125I）を底面に含まれるシンチレータに近接させることによって、その放射線が光シグナルに変換されます。生成される光シグナルの量は、放射性同位元素の量に比例します。
シンチレータはプレートに埋め込まれているため、シンチレーションカクテルの添加は不要です。
SPAビーズベースのアプローチと同様に、このプレートは洗浄工程無しで、ハイスループットな分析が実行可能です。
放出された青色光は、フォトマル（PMT）ベースの測定器を使用して検出および定量化できます。Cytostar-Tプレートは、DMSOまたはエタノールを（<5％（v / v））用いることも可能です。
また、Cytostar-Tプレートはインキュベーションの溶液の蒸発を最小限にする蓋が付いています。蓋にはリングが組み込んであり、ウェル間の汚染のリスクを軽減すると同時に、個々のウェルからの蒸発を低減します。
Cytostar-Tプレートの底面にはシンチレータが存在するので蛍光顕微鏡は使用できません。

Cytostar-Tシンチレーションマイクロプレートの原理

Cytostar-Tシンチレーションマイクロプレートの原理。

重要なポイント

以下は、プレートの最適な機能と結果を得るために重要なポイントになります。

・底面との接触を保持したままの再現性のある単細胞層の使用
・カウント条件の最適化
・個々のプレート内での適切なコントロールの使用

細胞培養プロトコル

Cytostar-Tプレートは、96ウェルまたは384ウェルがあり、細胞培養用に設計された他のマイクロプレートと同様に使用できます。

プレートに播種した後、24時間培養するための一般的なプロトコル

プレートの機能にとって、用いる細胞株を適切に単層培養することが重要です。単層細胞は、すべての実験操作を通じて底面と接触したままである必要があります。
また、ウェル内の播種密度を均一にして、ウェル間のぶれを抑えることが必要です。
以下のプロトコルは、典型的な接着細胞株用であり、適宜カスタマイズすることもできます。
浮遊細胞の使用またはトリプシンが必要となる細胞株については最適化が必要になります。

細胞培養プロトコル

 

細胞培養プロトコル

アプリケーション

・放射性標識リガンド結合アッセイ
・チミジン取り込みアッセイ
・グルコース取り込みアッセイ

その他のアプリケーション

・細胞周期研究
・細胞シグナル伝達
・in situ RNA検出
・アラキドン酸の放出
・イオンフラックス測定
・細胞接着
・薬物代謝
・細胞の運動性

装置と計測

エネルギーウィンドウ設定

検出機器のデフォルトの設定はCytostar-Tプレート用に最適化されていない可能性があるため、アッセイウィンドウを調整します。機器のデフォルト設定は通常、液体シンチレーションカウンティングまたはSPAビーズアプリケーション用になっています。最適化されたウィンドウ設定により、選択した同位体の感度が最大になり、バックグラウンドが減少します。

マイクロプレートシンチレーションカウンターのアッセイウィンドウの例
マイクロプレートシンチレーションカウンターのアッセイウィンドウの例

クエンチング補正

Cytostar-Tプレートのクエンチング（消光）のメカニズムは、シンチレータの性質により、従来の液体シンチレーションのメカニズムとは異なります。

シンチレータは底面のポリマーに存在しているため、ケミカルクエンチングの影響を受けません。
化合物によってはカラークエンチングが生じ、プレートのカウント効率が低下します。これは通常、問題にはなりませんが、フェノールレッドを含まない培地と無色のバッファーを使用することで、カウント効率が向上し、カラークエンチングが抑えられます。プレート全体で異なる濃い色の溶液を使用する場合は、クエンチングの補正を行うことで、ハイスループットでの実験が可能になります。

カラークエンチングは、一連のタートラジン（または適切な着色試薬）溶液で作成された標準曲線を使用して補正されます。

クロストーク補正

Cytostar-Tプレートのシグナルを発するウェルに隣接する空ウェルのカウントは、光学的クロストーク、または放射性同位元素のクロストークによって生じる可能性があります。

マイクロプレートの底面をマスクすることで、光学的クロストークの影響を抑えることができます。
放射性同位元素のクロストークは、エネルギーの高い粒子によって発生しますが、補正することが可能です。細胞生物学の研究で一般的に使用される同位体の場合、クロストークは5％未満であり、補正は必要ありませんが、125Iは放出されるガンマ線のために約10％のクロストークを発生させます。

溶液バックグラウンドのカウント

放射性標識化合物を含む溶液をプレートに入れると、カウントが生成します。このカウントは、溶液バックグラウンドカウントと呼ばれ、放射性同位元素の放射線エネルギーと放射線が水溶液中を移動する距離に依存します。したがって、その放射性同位元素の放射線エネルギーの最大距離を超える位置からはシグナルに寄与しません。放射能濃度の増加に対するプレートの応答は線形です。

典型的なCytostar-Tシンチレーションマイクロプレート効率データ

典型的なCytostar-Tシンチレーションマイクロプレート効率データ
レビティ社製のMicroBetaカウンターで生成されたデータ。括弧内の数字は、TopCountカウンターで導出された値を示しています。