チミジン取り込みアッセイ

応用	化合物	specific activity(/mmol)	Rad. conc. (GBq/mL)	Packaging buffer	保存温度	Notes	カタログ番号
DNA増殖	Thymidine, [methyl-³H]	74 GBq	37	Steri-packaged, aqueous solution	5°C	1ヶ月以内の使用を推奨します	NET027A
		248 GBq	37	Steri-packaged, aqueous solution	5°C	1ヶ月以内の使用を推奨します	NET027
		740 GBq	37	Steri-packaged, aqueous solution	5°C	1ヶ月以内の使用を推奨します	NET027X
		740 GBq	37	70% ethanol	-20°C		NET027E
		851-999 GBq	37	10% ethanol	5°C		NET027L
		1.48-2.22 TBq	37	2% ethanol	5°C		NET027W
		2.59-3.33 TBq	37	Steri-packaged, aqueous solution	5°C	1ヶ月以内の使用を推奨します	NET027Z
Total nucleic acid proliferation	Thymidine, [2-¹⁴C]	>1.85 TBq	3.7	Steri-packaged, aqueous solution	5°C		NEC156
Total nucleic acid proliferation	Thymidine, [6-³H]	>370 GBq	37	Steri-packaged, aqueous solution	5°C		NET355
DNA probe labeling	Deoxythymidine triphosphate, [methyl-³H]	370-925 GBq	37	50% ethanol	-20°C		NET221H
		2.59-3.33 TBq	37	50% ethanol	-20°C		NET221X
		2.59-3.33 TBq	92.5	10 mM Tricine buffer pH 7.6	-80°C		NET221A

チミジンの選択

以下にチミジンの選択のためのヒントを示します。

トータル、またはDNAのみの標識：
チミジンはDNAとRNAの両方を標識します。しかし、³H標識メチルチミジン（メチル基に標識したチミジン）はDNAのみを標識します。

安定性or毒性：
エタノールを含む製品は保存期間が長くなりますが、細胞毒性を示す場合があります。一方でエタノールを含まない製品は毒性が低くなりますが、有効期間は短くなります。

使いやすさ：
特定の数値の比放射能となっている製品の場合は、毎回同じ量を実験に使用できるので簡便です。
一方で、比放射能が変動する製品の場合は、高いシグナルが得られますが、使用量を都度計算する必要があります。

シグナルor安全性：
比放射能が高いとシグナルが高くなりますが、保管中の安定性は低くなります。

増殖試験orプローブ標識：

チミジンとメチルチミジンは細胞増殖試験に使用され、チミジン三リン酸（Deoxythymidine triphosphate）は細胞に取り込まれないので、プローブの標識用に使用されます。

プロトコル概要

CytoStar-Tプレート（384ウェル）を用いたプロトコル

・162 cm₂のフラスコで、5％CO₂、37℃で細胞を増殖させ、サブコンフルエントな状態まで培養します。指数関数的に増殖している細胞は、最大のチミジン取り込みを示します。
・トリプシン処理によって細胞を剥がし、得られた懸濁液中の細胞数を計算します。
・懸濁液を播種密度に希釈し、40μL/ウェルを分注し、一晩インキュベートします。
・ウェルから培地を除去し、50μL /ウェルのPBSで洗浄します。¹⁴C標識メチルチミジンを培地で23.13 kBq/ mLに希釈します。希釈液80μLをウェルに加え、最終濃度を1.85 kBq/ mLにします。
・バックグラウンドカウント用のコントロールウェルの培地に¹⁴C標識メチルチミジンを添加します。
・透明なプラスチックプレートシールでプレートを覆い、プレートを測定します。
・プレートシールを慎重に取り外し、プレートの蓋と交換します。測定したプレートをインキュベーターに戻します。プレートを適切な間隔で測定します（例：24時間~72時間ごとに測定）。
・細胞の増殖と形態について顕微鏡下で定期的に確認してください。