17. イメージングプレート(IP)によるダブルラベル試料の分析†

小幡年弘*， 岩本浩二**， 白岩善博***， 中島栄一***，河合賢司***， 進藤英世****

*筑波大学大学院生命環境科学研究科， **同大学生物科学系
305-8572　茨城県つくば市天王台 1-1-1
***三共(株)薬物動態研究所
140-8710　東京都品川区広町 1-2-58
****ラジオルミノグラフィ研究会
167-0042　東京都杉並区西荻北 4-17-12

Key Words :ImagingPlate(IP),double-labellingradioluminography(RLG),-rayprotector,selenium-75,sulfur-35,selenoproteins,carbon-14,tritium,double-labelling autoradiography, color-autoradiography

† Instruments for Radiation Measurement in Biosciences ： Series 3. Radioluminography.
17. Analysis of Double-labelled Samples by the Imaging Plate (IP).
Toshihiro OBATA*, Koji IWAMOTO**, Yoshihiro SHIRAIWA***, Eiichi NAKAJIMA***, Kenji KAWAI*** and Hideyo SHINDO** ：
*Graduate School of Life and Environmental Sciences, **Institute of Bio-logical Sciences, University of Tsukuba, 1-1-1 Tennoudai, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref. 305-8572, Japan, ***Drug Metabolism and Phar-macokinetics Research Laboratories, Sankyo Co., Ltd., 1-2-58 Hiromachi, Shinagawa-ku, Tokyo 140-8710, Japan, **The Association of Radioluminography, 4-17-12 Nishiogi-Kita, Suginami-ku, Tokyo 167-0042, Japan.

拡大	図 1　ダブルラベル法における各核種検出の原理

セレン (Se) は硫黄 (S) と同族の元素であり， 物理化学的性質が類似している。 そのため生体内では蛋白質中のシステインおよびメチオニンの硫黄と置換してセレノシステインおよびセレノメチオニンとして存在し， 動物においては必須元素として知られている8)。 与えられたセレンの生体内での挙動は硫黄のそれと類似しており， 置換される場合が多い。 セレン含有アミノ酸のうち， セレノメチオニンはメチオニン ： tRNAmet リガーゼの基質となり， メチオニンの代りに蛋白質中へ取り込まれると考えられる。 一方， セレンが特異的に配位される物質もあり， おのおのの物質の機能にセレン置換が大きな影響を与える場合もある。 セレノシステイン含有蛋白質については， ポリペプチド鎖中のセリンまたはシステイン残基がセレノシステイン残基に変化する場合と， セレノシステインに特異的なコドンおよび tRNA が存在し， 蛋白質生合成の過程で直接蛋白質中に取り込まれる場合の二とおりの可能性がある。 実際， 後者については， 通常の終止コドンの一つである TGA によりコードされており， 蛋白質合成において 21 番目の蛋白質構成アミノ酸として認識されている9)。 また， セレンは硫黄に比べて還元力が強いという特徴があり， これが酸化還元酵素の活性に利用されている。 過酸化物の還元に働く酵素であるグルタチオンペルオキシダーゼでは， 活性の発現に活性中心のセレノシステインが必須であり， 動物のセレン要求性の原因となっている9)。

これらのことから， 生体内におけるセレンと硫黄の挙動は深く関連していることが予想され， 35S と 75Se のダブルラベル分別法の開発により， 生体内における硫黄およびセレン含有蛋白質の生理作用， および両元素の相互作用の解析がより容易になるものと期待できる。

2.2　75Se／35S ダブルラベル実験法

2.2.1　原理

同一膜試料上に混在するβ線放出核種ラベル物質， γ線放出核種ラベル物質およびβ／γ核種ダブルラベル物質を区別して検出するために， β線およびγ線の物質透過率の差を利用し， これを RLG 法で行うのが本法である。 実際に筆者らの実験に用いた方法は以下のとおりである。 ① 35S ( β線放出核種)， および 75Se (γ線放出核種) の双方を同時， または一定の時間的経過を経て与える。 RI ラベルされた生体試料より抽出した蛋白質を SDS-ポリアクリルアミド電気泳動 (PAGE) で分離後， それらの蛋白質をブロッティング膜に転写し， 固定乾燥する。 その膜を試料としてユニバーサル型 (UR 型) の IP にコンタクトさせ， 密着露光させる (75Se および 35S 全ラベルバンドの検出)。 ② 同じ試料と IP の間にβ線を完全に遮蔽する薄い遮蔽材を挟み込み， 再び密着露光させる (75Se-ラベルバンドの検索)。 ③ おのおのの IP を BAS-5000 を用いておのおのの RI ポジティブバンドを検出し， おのおのの PSL 値を測定する。 ④ IP 検出画像を重ね合わせるなどのデータ解析を行う。 以上の操作によりダブルラベル物質を含む各 RI ラベル物質を検索する。

2.2.2　標準試料の作成

polyvinylidine difluoride (PVDF) 膜にγ線放出線源として約 20000cpm のNa275SeO3(5 L) (Se スポット) とβ線放出線源として約 20000cpm の Na235SO4(5 L) (S スポット) をスポットし， 試料として使用した (図 2F)。 クロストークを防ぐため， スポット間は 2cm 以上離し， 同一膜上に同じスポットを二つ並べて実験を行った。 RI 試料と IP の間に遮蔽材を挟んで数分間露光した後， BAS-5000 (富士フイルム， 東京) を用いて Latitude 4, S10000 でスポットを検出した。 放射線量の定量には FUJI FILM Science Lab98 Image Gauge ver. 3.1 (富士フイルム， 東京) を用い， 同一試料あたり二つのスポットの PSL 強度を定量し， その平均値を用いた。

2.2.3　最適な遮蔽材の選択

本法で求められる遮蔽材の必要条件はβ 線の透過率がゼロで，γ線の透過率が高いことである。 また， SDS-PAGE ゲル上の隣接する蛋白質のバンドの間隔は数 - 数百ミクロンである場合が多く， 厚みがあるとクロストークの原因となるため， IP と試料との密着性に関する影響を最小限にする薄膜が望ましい。 はじめに遮蔽効果の大きい厚さ 0.3mm の鉛板 (密度 340mgcm2， 千代田テクノル， 東京) を用いて実験を行った結果， 35S によるβ 線は完全に遮蔽され，γ線放出核種である 75Se のみが検出された (図 2 )。 遮蔽材なしのときには 75Se および 35S の双方を重ねたスポット (Se＋S) の PSL 強度は， 75Se試料(Se)と 35S 試料(S)のスポットの合計になるが， 鉛の遮蔽によって Se スポットの PSL 強度と等しくなることから(図 3)， 本法により，β線放出核種とγ線放出核種の両方でラベルした試料からγ線のみを検出することが可能である。

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図 2　75Se および 35S 標準試料の検出イメージ AE, 0.3mm 厚の鉛板による放射線の遮蔽効果 (露光時間 ： A, 10 分 ； B, 20 分 ； C, 30 分 ；D, 60 分 ； E, 120 分) F, 対照 (遮蔽材なしで 20 分間直接露光)。 G, バックグラウンド測定位置。 75Se, Na275SeO3(20000cpm) のスポット。 75Se＋35S, Na275SeO3(20000cpm) をスポットし, 乾燥後Na235SO4(20000cpm) を重ねたスポット。 35S, Na235SO4(20000cpm) のスポット。 ただし， IP 膜の RI 汚染を防ぐために， サランラップフィルムを IP 膜と RI 試料の間に使用。

拡大	図 3　鉛板による遮蔽効果 遮蔽なし () の場合と， 0.3mm 厚の鉛板で遮蔽した場合 () の Se スポットの PSL 強度をそれぞれ 100 としたときの他スポットの PSL 強度。 S, 35S のみ ； Se, 75Se のみ ； S＋Se, 35S と 75Se を重ねてスポットしたもの。

鉛板を用いてβ線を完全遮蔽してγ線のみを検出することは可能であるが， 同時にγ線の約 80％ も遮蔽効果により減少しており， 放射活性の低い試料では利用できない。 また， 試料と IP の距離が離れているため放射線の拡散が大きく， 画像が不鮮明になる。 そこで本法に最適な遮蔽材の検索を目的として鉛板， アクリル板 (厚さ 2mm, 密度 235mgcm2, 共和ガス化学工業, 東京)， アルミ箔 (厚さ 25m, 密度 38mgcm2, ニッパク, 東京)， 鉛箔 (厚さ 50 m, 密度 56.2mgcm2， 千代田テクノル， 東京)， マイラーフィルム (厚さ 8 m， 密度 9mgcm2， アロカ社， 東京)， ラミネートフィルム (厚さ 25m, 密度 23 mgcm2, アスカ, 東京) について検討した。 それぞれの遮蔽材に対して遮蔽材の厚さを変えて一定時間露光を行い， 直接露光したときの PSL 強度を 100％， バックグラウンドを 0 ％として透過率を比較した (図 4A-F)。 前述のように厚さ 0.3mm の鉛板はβ線を完全に遮蔽し，γ線も約 80％ 遮蔽した。 厚さ 50m の鉛箔でもγ線の約 70％ が遮蔽された。 アルミ箔では 250 m まで十分なβ線遮蔽効率が得られず， このときγ線の約 60％ が遮蔽され， 鉛と同様の傾向が見られたことから， 双方ともに遮蔽材としては不適当であった。 アクリル板は遮蔽効果が弱く，β線を十分に遮蔽するには 4 mm の厚さが必要であり， このときγ線も 60％ 遮蔽された。 さらに放射線の拡散も大きく，遮蔽材としては不適切であった。 マイラーフィルムは 1 枚が 8 m と薄いにもかかわらず，β線に対して 10 枚で約 85％ の遮蔽効果を示した。 このときγ線の遮蔽は約20％ であり，拡散も少なく，本法に適していた。またラミネートフィルムは 1 枚で十分にβ線を遮蔽し，γ線の遮蔽は 30％ であった。 マイラーフィルムやラミネートフィルムは制動放射線が発生しにくいので拡散が少なく， 物質密度が高いため高い遮蔽効率を示したと考えられる。 本法にはどちらも適していたが， 扱いやすさ， 入手の容易さから， 今回試験した中ではラミネートフィルムが最適であると判断した。

拡大	図 4　遮蔽材の厚さと放射線の透過率の関係 A, 鉛板 ； B, 鉛箔 ； C, アルミニウム ； D, アクリル板 ； E, マイラーフィルム ； F, ラミネートフィルム, G および H, 75Se および 35S の遮蔽材 (A-F) の密度と遮蔽率の関係。

2.3　75Se／35Sダブルラベル蛋白質の検出法の応用例

海洋性単細胞石灰藻 (円石藻) Emiliania huxleyi は細胞内の小胞中でコッコリスと呼ばれる CaCO3 結晶を合成し， それを細胞表面に配置するユニークな植物プランクトンである。 そして， ときに数千 km2 にも及ぶ大繁殖 (ブルーム) を起こすことから海洋における大規模 炭素循環媒介者として注目されている。 円石藻はその生育における必須微量元素としてセレンを要求することが見いだされており， セレンが増殖の重要な制御因子と推定されている10)11)。 筆者らは 75Se を用いたトレーサ実験を行い， セレンが特定の蛋白質中に含まれることを発見し， これをセレン要求性の原因と推定した。 しかし， 蛋白質へのセレンの取込みは， セレンに特異的な場合の他に， 硫黄との濃度比により含硫アミノ酸であるメチオニン， およびシステインに非特異的に取り込まれる場合がある。 後者の場合， 蛋白質中のセレンと当該蛋白質の機能は無関係であり， セレン要求性の原因とは考えにくい。 そこで蛋白質へのセレン取込みの特異性を確認するために本法による解析を試みた。

まず， シングルラベル法によるラベル蛋白質の検索を行った。 Na275SeO3 のみを含む培地で培養した細胞と， 35S-メチオニン／システイン (35S-MetCys, Pro-mix L-［35S］ in vitro cell labelling mix, Amersham-Pharmacia) カクテルのみを含む培地で培養した細胞のそれぞれについて細胞から超音波破砕により蛋白質を抽出し， 細胞抽出液とした。 抽出液に対して SDS-PAGE を行い， ゲルを乾燥後， 75Se を含む試料は 15 時間， 35S を含む試料は 20 時間， 別々に遮蔽材を用いずに露光した (図 5 )。 蛋白質染色剤 (CBB) により検出されるバンドのうち 75Se でラベルされたバンドは 28.9 および 25.4kDa の二本であり (図 5A)， 35S ラベル蛋白質は多数検出されたが 28.9 および 25.4kDa 蛋白質のラベルは他と比べ弱いものであった。 これより， この 28.9 および 25.4kDa の蛋白質が， 特に 75Se によってラベルされたセレン含有蛋白質 (セレノプロテイン) であると判明した。

主要臓器についてシングルおよびダブルラベルのマウス RLG 画像で求めた組織中濃度の相関性を図 14 に示した。 両測定結果はよい相関性が見られたが， 図 13C② に見られるようにピクセル単位で差し引きをした画像では位置のずれによると思われる残像が組織の周辺などに明確に現れており， 今後の改善課題として残されている。

４.　今後の展望および課題

2種の化合物の取込みパターンを同一生物試料上で比較できるのが本法のメリットである。 別々の試料で比較することも可能だが， 同一試料で行うことにより実験操作が簡略化でき， 個体差や実験条件の誤差を排除できるのでデータの信頼性も向上する。

今回の 75Se／35Sダブルラベル実験のように 2 種の核種がそれぞれγ線放出核種とβ線放出核種で， おのおののエネルギー差が大きく， エネルギーレベルも比較的高い場合， 取込みの相互作用の解析等に本法の応用が可能であると思われる。 また，β線放出核種同士であっても， 3H／14C のようにエネルギー量や飛程に差がある場合， それを利用して適当な遮蔽材を選択することにより有用な手法が開発可能であることが示された。

3H／14Cダブルラベル RLG 法の場合， IP の 3Hβ線に対する感度が 14Cβ線に比べて低いことが改善すべき重要な問題である。 さらに， 画像間の減算処理方法の改善が強く望まれる。

今回記述した 75Se／35Sダブルラベル法の場合， 定性的な解析に加え， 定量的な解析を導入することが不可欠である。 今後標準試料を作成し， 遮蔽材によるγ線の減弱率を求め， ソフト上の数値補正によりγ線強度を求めるシステム開発が必要である。 さらに， この方法によって検索し精製した蛋白質の解析が次の重要なステップであるが， 大学などではそれらに不可欠な分析機器がRI施設にかならずしも完備されていないことが別の面での解決すべき重要な課題となっている。


謝　　辞

75Se／35S ダブルラベル実験にあたり有用なご示唆とご協力をいただいた金沢大学理学部和田敬四郎教授に感謝いたします。 また， カラーオートラジオグラフィ用フィルムを作成してくださったコニカ桑原義美博士， 故平田　明博士はじめ同社研究室の皆様に厚く感謝申し上げます。



文　　献

1)　宮原諄二 ： イメージングプレート―新しい放射線画像センサー―， 現代科学， 10月号， 29-36 (1989) 　
2)　栗原紀夫， 中島栄一 ： 二次元放射能分布検出・定量・画像化システム，Radioisotopes,４２,541- 548 (1993) 　
3)　中島栄一， 中畑則道 ： ラジオルミノグラフィによる二次元放射能分布検出， 定量， 画像化システムの進歩， 同上， ４４， 543-554 (1995) 　
4)　栗原紀夫， 中島栄一， 高橋千太郎 ： RLG 技術利用研究者へのアンケート結果， 同上， ４７， 864-871 (1998) 　
5)　中島栄一， 河合賢司 ： ラジオルミノグラフィによる放射能測定の一般的技術に関して， 同上， ４７， 953-965 (1998) 　
6)　森　啓司 ： BASシステムに関する FAQs， 同上， ４８， 48-62 (1999) 　
7)　長塚伸一郎 ： 装置の面均一性と測定値の直線性のバリデーション， 同上， ４８， 132-145 (1999) 　
8)　江崎信芳， 田中英彦， 左右田健次 ： セレニウム， 活性酸素" (浅田浩二編)， pp. 365-371， 共立出版， 東京 (1988) 　
9)　Stadtman, T. C. ： Selenocysteine, Annu. Rev. Biochem., ６５, 83-100 (1996)
10)　Danbara, A. and Shiraiwa, Y. ： The requirement of selenium for the growth of marine coccolithophorides, Emiliania huxleyi, Ge-phyrocapsa oceanica and Helladosphaera sp. (Prymnesiophyceae), Plant Cell Physiol., ４０, 762-766 (1999)
11)　檀原明子，白岩善博：円石藻Emilianiahuxleyiのセレン要求性と生育培地の選択， 日本海水学会誌， ５３， 467-484 (1999)
12)　進藤英世， 中島栄一， 桑原義美， 平田　明， 杉田定男， Radioisotopes， １７， 433-440 (1968)
13)　中島栄一， 河合賢司， 古田嘉壮， 柴部禎巳， 薬物動態， ９， S411 (1994)
14)　中島栄一， 安川勝衛， 篠崎速雄， 松原行雄， 藤下繁人， 岡野伸一， 同上， ３， 747-760 (1988)