RIA 法による血中インスリン量の測定

ラジオアッセイとは、放射性同位元素で標識した抗原や抗体、又は生理活性物質等を用いて、これらが関与する特異的結合反応を行い、その結合結果から得られる放射能を測定することで物質の定量を行なう方法である。代表的なものとして、ラジオイムノアッセイ（放射免疫測定Radioimmunoassay,RIA）法とイムノラジオメトリックアッセイ（免疫放射定測定Immunoradiometric assay, IRMA）法がある。

RIA 法は抗原ー抗体反応をその測定原理とすることから、抗原、抗体および標識抗原による競合反応を利用する。これらの競合反応の結果、抗体と反応しなかった標識抗原（F）または標識抗原ー抗体結合体（B）のうちいずれかの放射能を測定することにより、非標識抗原（測定対象物であるインスリン）の定量が行える。IRMA 法は抗原中の異なる2 か所にそれぞれ結合する2 種の抗体が用い、そのうち一方はポリスチレン（固相）などのビーズやチューブに固定、他方は125I などの放射性同位元素で標識されている。

両抗体とも抗原の異なる箇所にいずれも抗原抗体反応でそれぞれ結合し、「固相結合抗体ー抗原ー標識抗体」複合体が作られる。測定試料中の抗原量が増えるに伴い標識抗体、及び固相の放射能量も増加することから、既知の標準抗原を用いて作製した標準曲線から抗原の定量を行なうことができる。なお、2 つの抗体で抗原をはさむことからサンドイッチ法とも呼ばれる。

主な準備物

実験器具

マイクロピペット（100μL, 100μM）各1 本
チップ必要数
試験管必要数
試験管立て 1 式
アスピレータ 1 台
ミキサー 1 台

実験機器

遠心分離器 1 台
ガンマカウンタ 1 台

試薬の調製（シアノリアインスリン）

・ヨウ化インスリン（¹²⁵I）溶液
・ヨウ化インスリン（¹²⁵I）溶液をそのまま用いる（黄色）。
・インスリン抗血清溶液
・インスリン抗血清溶液をそのまま用いる（青色）。
・第二抗体懸濁液
・第二抗体懸濁液試薬を十分混和して用いる。
・標準インスリン溶液
・標準インスリン溶液（0, 3, 30,100, および240μU）をそのまま用いる。

実験操作

（1）標準インスリン溶液の添加；0、3、10、100 および240μU/mL の標準インスリン溶液を0.1mL ずつ標準曲線用試験管（No 3〜No 14）に入れる。

（2）未知検体の添加；未知検体用試験管（No 15〜）に未知検体（血清）を0.1 mL 入れる。

（3）ヨウ化インスリン（¹²⁵I）溶液（黄色）の添加；No 1 および2 を含む全ての試験管にヨウ化インスリン（125I）溶液を0.1 mL ずつ加える。ただし、No 1 および2 の総放射能測定用試験管はヨウ化インスリン（¹²⁵I）溶液後、直ちに栓をして放射能測定時まで静置する。

（4）インスリン抗血清溶液（青色）の添加；No 3 以降の全ての試験管にインスリン抗血清溶液を0.1 mL ずつ加え、十分混和する。

（5）第1 インキュベーション；20〜30℃で2 時間静置する。

（6）第二抗体懸濁液の添加；第二抗体懸濁液をNo 3 以降の全ての試験管に1 mL ずつ加え、十分混和する。

（7）第2 インキュベーション；20〜30℃で30 分間静置する。

（8）遠心分離；室温、2000ｘｇで10 分間遠心分離する。

（9）上清の除去；No 1 および2 の試験管を除き、全ての試験管の上清をアスピレーション又はデカンテーションにより除去する。

（10）放射能の測定；全ての試験管の放射能をガンマカウンタで測定する。

（11）標準曲線の作成；・標準インスリン0μU/mL（No 3 および4）から得られた平均放射能をBo とした場合の各試験管のB/Bo(%)を求める。
・片対数グラフ用紙の横軸（対数目盛）にインスリン濃度を、縦軸にB/Bo(%)値をとり、上で求めた各標準インスリン溶液のB/Bo(%)をプロツトし、標準曲線を作成する（図1 参照）。
・未知検体のB/Bo(%)を標準曲線に対応させ、検体中のインスリン濃度を求める。

図1 RIA 法でのインスリンの標準曲線