In vitroキナーゼアッセイ

培養細胞や大腸菌から精製したタンパク質リン酸化酵素（キナーゼ）を用いてのリン酸化酵素活性能の解析やタンパク質のリン酸化部位の同定に用いる手法である。キナーゼによる基質タンパク質へのリン酸基転移反応にはγ-³²P-ATPを用い、リン酸化された基質を液体シンチレーションカウンターで定量あるいは電気泳動後で分離後にイメージングアナライザーで解析する。

材料

1）キナーゼ：
・細胞から免疫沈降精製する場合にはIP専用抗体を用いる。
・大腸菌から精製する際にはtag精製カラムを用い、SDS-PAGEにて目的キナーゼがメインバンドであることを確認する。
・現在、主要なリコンビナントキナーゼについては高精製度のものが市販されている。

2）基質タンパク質
・キナーゼ特異的な基質タンパク質やリン酸化部位を含むポリペプチドを用いる。アミノ酸数が少ないポリペプチドを用いるとリン酸化効率が高い傾向がある。特にポリペプチドを用いる場合にはGSTやGFP等のtagをつけて分子量をかさ上げするとイメージングの際に見やすい位置にすることが出来る。

3）酵素反応バッファー
キナーゼによって至適pH、塩濃度等が異なる。文献等で調べた上で調製する。反応中におけるタンパク質の分解や脱リン酸化を抑制するために適宜、プロテアーゼ阻害剤やフォスファターゼ阻害剤を添加する。
Ex1) 　MAPK kinase reaction buffer：25 mM Tris-HCl (pH7.5)、5 mM β-Glycerolphosphate、2 mM DTT、10 mM MgCl₂Ex2)　 AKT kinase reaction buffer: 10 mM MOPS/NaOH (pH 7.0), 1 mM EDTA, 10 mM MgCl₂

4）γ-³²P-ATP
(製品一覧はこちらをご覧下さい)
リン酸基転移反応にはγ位に放射性標識されたリン酸基が必要である。α-³²P-ATPと間違えないようにする。また半減期が2週間程度であるため、計画的に実験を行う。
・0.37 MBq/reaction

5)　液体シンチレーションカクテル
（液シンを使用する場合）

6）ゲル固定液
（ゲル乾燥を行う場合）
・50% Methanol, 10% Acetic acid

7) CBB染色液
（ゲルを染色する場合）

器具・機器

1）ブロックインキュベーター
酵素反応を30−37℃で行う。振盪出来るタイプもある。

2）泳動槽
（SDS-PAGEを行う場合）

3）ゲル乾燥装置
（イメージングを行う場合）

4）イメージングプレートおよび画像解析装置
（イメージングを行う場合；GE社 FLA9000, BAS2500 series等）

イメージングプレート(IP)は湿気を嫌うので、保管に気をつける。またゲルはラップで包み、直接、ゲルがIPに触れないように注意する。IPが汚れた場合には99％エタノールで軽く拭く（水を用いないこと）。

5）液体シンチレーションカウンター
（放射性ペプチドの定量に用いる; Perkinelmer社Tri-carb series等）

事前準備

キナーゼの特異的な基質となるリコンビナントタンパク質・ポリペプチド（数十〜数百アミノ酸程度）を10 ng〜500 ng程度、キナーゼ画分（1×10⁷ cells ≦の細胞から免疫沈降精製したもの）や大腸菌等から精製したリコンビナントキナーゼ (10 ng〜1μg; キナーゼのユニット数に応じる)を氷上に静置し、溶解させておく。
酵素反応液を調製する（酵素の種類によって組成は変わる）。またプロテアーゼ阻害剤やフォスファターゼ阻害剤は要事調製して添加する。

実験方法

実験手順

Add 1μg of substrate to a microcentrifuge tube.
Add 10 ng of active protein kinase.
Add a kinase buffer (12.5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM MgCl2, 100μM cold ATP, 0.37Bq[γ-³²P]-ATP) for a final volume of 40μl.
Incubate with agitation for 30 min at 30℃.
Stop the reaction by adding EDTA or 2 ×SDS-sample buffer.
Measure.（ see below ）

解析方法

液体シンチレーションカウンターによる定量を行う場合 解析手順）

Transfer a 10−40 μl aliquot of the kinase reaction onto the center of P81 phosphocellulose paper.
Wash the paper three times with 0.75% phosphoric acid for 10 min.
Wash the paper once with aceton for 3 min.
Transfer the paper to a scintillation vial and add scintillation cocktail.
Read in scintillation counter. Compare the CPM of enzyme samples to the CPM of control samples that contain no enzyme or no substrate.

イメージングアナライザーによる画像解析を行う場合

解析手順）

The kinase reactions were stopped by the addition of 2×SDS sample buffer and then subjected to SDS-PAGE.
After electrophoresis, the gel is washed with the gel-fixing solution (50% methanol, 10% acetic acid, 40% H₂O) for 60 min at room temperature with agitation.
Gel drying at 65℃ for 120 min.
Exposure imaging plate (IP) directly through the Saran Wrap.
Analyzing with an Imaging device.

注意点・ワンポイントアドバイス

特に培養細胞や大腸菌から精製したキナーゼを用いる場合には、不純物や他の成分の混入を避けることが難しいため、キナーゼの有・無や特異的阻害剤を用いてリン酸化が目的とするキナーゼによるものであることを確認する。
酵素・基質の量や反応時間は複数ポイント用意し、反応に直線性がある範囲で行う。
用いるキナーゼが自己リン酸化能を有する場合、自身と基質の両方がリン酸化される。お互いの分離量が近いときにはタグ等をつけて可視化したときに区別出来るようにする。
乾燥させたゲルをIPに露光する前に、GMサーベイメーターで計測してみる。たとえ針が振れなくても7−14日間位露光するとバンドを可視化できる場合もある。

製品とカタログ番号

Compound	Specific Activity (/mmol)	Rad. conc. (/mL)	Molar Concentration (μM)	EasyTides Version Containing Dye in Buffer (Shipped ambient, store at 2-8°C)	Frozen Version (Shipped on dry ice, store at -20°C)
ATP,[γ-³²P]	370 GBq	74 MBq	200		BLU002
	111 TBq	185 MBq	1.7	BLU502H	BLU002H
	111 TBq	370 MBq	3.3	BLU502A	BLU002A
	222 TBq	370 MBq	1.7	BLU502Z	BLU002Z
	222 TBq	5.55 GBq	25		BLU035C
GTP,[γ-³²P]	222 TBq	370 MBq	1.7