DNAおよびRNA標識（総論）

・SP6、T3またはT7 RNAポリメラーゼによるin vitro転写
・ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）
・T4 DNAポリメラーゼまたはT7 DNAポリメラーゼによる3 '末端標識
・クレノウフラグメントによるランダムプライミングDNA標識
・AMVまたはM-MuLV逆転写酵素によるcDNA標識
・DNase 1およびDNAポリメラーゼ1によるニックトランスレーション標識
・TaqまたはPfuのような好熱性DNAポリメラーゼによるPCR標識

得られた標識プローブの利用用途

・in situハイブリダイゼーション
・マイクロアレイ分析
・DNAシークエンシング
・サザンブロッティング
・ノーザンブロッティング

酵素とヌクレオチドの関係について

当協会は、さまざまな³²P、³³P、および³⁵S標識ヌクレオチドを提供しており、放射性標識ヌクレオチドは、αリン酸またはγリン酸のいずれかで標識されています。

酵素アッセイ（キナーゼによるリン酸化、ターミナルトランスフェラーゼによるオリゴヌクレオチドの末端標識など）を実施する場合は、酵素がヌクレオチドを基質としてどのように認識しているか等、酵素の働きを理解する必要があります。例えば、以下のようなポイントを押さえることが重要になります。

・ヌクレオシド一リン酸をDNAまたはRNA鎖の一部として組み込んでいるかどうか。
・末端のγリン酸基をヌクレオチドから別の基質に転移させるかどうか。
・2 '位がデオキシであるヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、dNTP）を使用する必要があるかどうか。
・3 '位がデオキシである「チェーンターミネーター」が必要かどうか。

ATPの構造

α、β、およびγリン酸基が示されています。

適切な放射性標識ヌクレオチドの選択については、こちらを参照してください。

DNAおよびRNA標識技術

オリゴヌクレオチドは、3 'または5'末端で標識できます。ポリヌクレオチドキナーゼおよび³²P-γ-ATPを使用して、5 '末端が標識されます。また、ターミナルトランスフェラーゼとαリン酸で標識されたヌクレオシド三リン酸をしようして、3 '末端が標識されます。

³²Pの他に³⁵Sと³³Pも使用されています。

³⁵Sおよび³³Pは、in situハイブリダイゼーションなどの高解像度、またはプローブの安定性が必要な場合に適しています。

一般的なDNAおよびRNAの標識方法と用語の説明：

標識方法の分類	説明
ランダムプライマー	プライマー標識の基本的な手法は、FeinbergとVogelsteinによって開発され、ヘキサヌクレオチドを使用して、ランダムにDNA合成するものです。 DNA合成はDNAポリメラーゼIまたはDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントのいずれかを用います。クレノウフラグメントは5 '→3'エキソヌクレアーゼ活性がないため、組み込まれた標識の損失がありません。この合成方法により、放射性標識されたヌクレオチドを組み込むことができ、109 dpm / µg DNAを超える比放射能のDNAプローブが得られます。
ニックトランスレーション	DNAをDNase処理し、二本鎖の一方のDNAにニックを入れます。次に、DNAポリメラーゼIを使用して、ニックの入った部位を置き換えます。 DNAポリメラーゼI は3 '末端を伸長させると同時に、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によってヌクレオチドを除去し、ギャップを作ると同時に放射性標識dNTPを取り込み置換していきます。プローブの標識にこの手法を用いる場合は、α位が標識されたdNTPを使用します。ニックは、DNAリガーゼによって閉じられます。
クレノウフラグメント	クレノウフラグメントは、DNAポリメラーゼIの5 '→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠いているため、放射性標識プローブの作製に有効です。クレノウフラグメントを使用して、DNAフラグメントの末端を標識することができます。放射性標識dNTPを使用して、凹んだ3 '末端を埋めたり、DNAが突出した末端を標識したりできます。
逆転写酵素	この反応では、逆転写酵素を使用してRNAからcDNAに逆転写されます。
好熱性DNAポリメラーゼ	他のDNAポリメラーゼと同様に、好熱性DNAポリメラーゼはヌクレオシド三リン酸からのDNA合成を触媒します。これらの熱安定性酵素はPCRで使用されます。合成を開始するにはフリーの3 '位のヒドロキシル基、さらにマグネシウムイオンが必要です。一般に、75℃〜80℃で反応が起こります。好熱性DNAポリメラーゼには、Taq、Pfu、Ventなどがあります。
DNA 3 '末端およびDNA 5' 末端標識	オリゴヌクレオチドプローブは、DNA合成装置を用いて数時間で、ターゲットとなるDNAまたはRNAの配列情報に基づいて効率的に合成されます。オリゴヌクレオチドプローブは非常に特異的であり、遺伝子の単一塩基の変化を検出するように設計できます。 DNAの3 '末端標識は、ターミナルトランスフェラーゼを使用することで行われます。DNA（またはRNA）の5 '末端標識は、T4 PNKを使用して行われます。
SP6 RNAポリメラーゼ	SP6はDNA依存的なRNAポリメラーゼであり、特定のSP6プロモーターを持つDNAテンプレートを使用します。SP6は、ハイブリダイゼーション用の標識RNAプローブの合成に使用されます。 SP6ポリメラーゼを使用して、18塩基対のプロモーター領域を含む短いDNAテンプレートからRNA配列を合成できます。
T7 RNAポリメラーゼ	T7 RNAポリメラーゼは、プロモーターを含むDNAテンプレートからのRNAの合成を触媒します。 T7ポリメラーゼはプロモーターに特異的であるため、T7プロモーターの下流にクローニングされたDNAのみを転写します。この反応には、DNAテンプレートとRNA合成の補因子としてのマグネシウムイオンが必要です。T7ポリメラーゼ活性は、BSAまたはスペルミジンによって活性化されます。
RNA 3 '末端標識	T4 RNAリガーゼは、RNAの3 '末端の標識に使用できます。この酵素は、放射性標識ヌクレオチドの5'位のリン酸末端と、3'-OH末端のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせる酵素である。補酵素としてATPが必要です。