51Crリリースアッセイ

⁵¹Crは、サンプルを遠心分離し、上清を収集することによって分離できます。遠心分離の上清は、ガンマカウンタで直接カウントするか、マイクロプレートでシンチレーションカクテルと混合して、液体シンチレーションカウンタで検出できます。

実験概要

⁵¹Crリリースアッセイの原理

手順は3つの主要なステップに分けることができます。
・⁵¹Crによる標的細胞の標識
・細胞溶解による⁵¹Crの放出
・および放出された⁵¹Crの検出

主な準備物

・⁵¹Cr
・細胞培養培地
・PBSなどのバッファー
・標的細胞を完全に溶解し、最大のシグナルを得るため（最大放出）のTriton-XやSDSなどの界面活性剤
・アッセイフォーマットに応じた、細胞培養用のチューブまたはマイクロプレート

製品およびカタログ番号

Compound	Specific Activity	Rad. conc.	Packaging buffer	Storage temp.	Half Life	Cat. Number
Sodium Chromate	>9.25 GBq/mg	185 MBq/mL	Saline, pH 8-10, sterile	Room Temperature	27.7 days	NEZ030
Sodium Chromate	>9.25 GBq/mg	37 MBq/mL	Saline, pH 8-10, sterile	Room Temperature	27.7 days	NEZ030S

プロトコル

⁵¹Crリリースアッセイのプロトコル
⁵¹Crの検出には、ガンマまたはベータ線を測定します。

コントロールの設定

自発的放出：
エフェクター細胞なしの標的細胞を培地またはバッファーのみでインキュベートします。

最大放出：
標的細胞を1-2％界面活性剤（SDS、Triton X-100など）添加済みの培地またはバッファーでインキュベートし、標的細胞を完全に溶解します。

特異的な溶解細胞の計算方法：
[（実験的に得られた放出-自発的放出）/（最大放出-自発的放出）] * 100。

アッセイの最適化

標的細胞の標識に使用される放射能の量、標的細胞標識のためのインキュベーションの時間、さらにE（エフェクター細胞）：T（標的細胞）比、およびE：Tインキュベーション時間などの実験条件は、使用される細胞タイプによって異なるため最適化が必要です。

ガンマ対ベータカウンティング

⁵¹Crはガンマ線放出核種ですが、電子捕獲によっても崩壊するため、ガンマカウンタでのガンマ線の検出の他、液体シンチレーションカウンタでオージェ電子および低エネルギーX線を検出することもできます。

プロトコルおよびデータ

プロトコル

・核タンパク質を発現する組換えvacciniaウイルス（10⁷ pfu）をP815標的細胞（2 x 10⁶）に感染させます。
・標識のために50 µlのIMDM（7.5％FCS）に1.85 MBqのNa₂⁵¹CrO₄を加えて1時間、標的細胞を再懸濁します。
・細胞を洗浄し、IMDMに再懸濁します。
・丸底96ウェルプレートに標的細胞10⁴/ウェル添加します。
・27：1、9：1、3：1、および1：1のE：T比でエフェクター細胞を添加します。37℃で4時間インキュベートします。
・自発的放出、最大放出を測定するためのコントロールを準備し、37°Cで4時間インキュベートします。
・サンプルを遠心分離し、上清を収集します。
・上澄み液30 µlをポリスチレンチューブ（ガンマカウント用）に加え、カウントします。
・もしくは液体シンチレーションカウンタで計測します。